實時熒光定量PCR（qPCR）徹底改變了科學家檢測和定量核酸靶標的方式，具有高靈敏度、速度快、可擴展性強等優勢。許多實時PCR實驗在每個反應孔中只檢測一個靶標，這種方式稱為單重qPCR（Singleplex qPCR）。
然而，通過一種稱為多重qPCR（Multiplex qPCR）的方法，可以進一步提升實時PCR的效率。多重qPCR允許在同一個反應孔中同時擴增并檢測多個相互獨立的靶標，從而在更少的反應次數中獲得更多數據，同時提高試劑利用率并改善實驗重復性。
無論是進行基因表達分析還是病原體檢測，多重qPCR都能有效簡化實驗流程。從單重到多重：工作原理。
一個典型的實時PCR實驗通常包含：一對引物
在使用染料法或TaqMan?探針法時，還包括一個帶有熒光標記的探針，在單重 qPCR實驗中，每個反應孔只擴增一個檢測項目。
在多重qPCR中，則可在同一個反應孔中同時擴增兩個或多個靶標，每個靶標通過帶有不同熒光染料的探針進行區分。
在現有的化學體系中，TaqMan探針法非常適合多重qPCR，因為：探針本身具有高度特異性，每個探針對應獨立的熒光信號。
這種“雙重優勢”使研究人員能夠在一次反應中擴增多個檢測項目，并分別對每個靶標進行準確檢測。
為什么選擇多重 qPCR？
與單重qPCR相比，多重qPCR具有顯著優勢：更高的通量，每孔檢測更多靶標，提高整塊反應板的檢測效率，更低的試劑和樣本消耗，更高效地利用昂貴試劑和有限的生物樣本。
更高的精密度與可靠性，同孔內的內參對實驗波動進行歸一化更高的數據可信度，與單重qPCR不同，所有靶標和內控在同一反應孔中完成，更具可比性通常，從雙重qPCR（Duplex）開始是一個現實可行的第一步。隨著技術發展，通過在單個反應中結合3個或更多靶標，多重qPCR的優勢將進一步放大。在Thermo Fisher Scientific提供的先進工具、服務和產品支持下，高階多重qPCR（最多6個靶標）已不再遙不可及。
什么時候最適合使用多重qPCR？
在以下情況下，多重qPCR的價值尤為突出：需要對大量樣本使用相同的一組檢測項目。
對數據質量和質量控制要求較高，樣本量有限或樣本十分珍貴，如果你的項目需要檢測的靶標數量很多（例如超過12個），那么使用實時PCR芯片陣列（qPCR Array）可能會更加高效。
隨著多重反應中靶標數量增加（3–6 個），實驗設計的復雜性也會顯著提升。此時，一些技術應用科學家（TAS）和現場應用科學家（FAS）可提供專業指導。
如何設計一個成功的多重qPCR實驗？
成功的多重qPCR流程需要合理的實驗設計與充分的測試，主要包括以下幾個方面：
選擇兼容的檢測項目，首先確定你希望組合的檢測項目。可實現的多重數量取決于儀器的光學檢測通道數。例如：如果儀器具備6個檢測通道，理論上最多可同時檢測 6個靶標。
可使用qPCR Assay Design Hub中的 Multiplexing Support Request Tool 檢查檢測項目的兼容性。多重支持團隊還可提供免費的計算機模擬分析，以識別潛在的引物或探針相互干擾問題。
選擇合適的熒光染料
合理的染料選擇有助于實現清晰的光譜區分。
推薦使用的染料包括：FAM、VIC ROX、Cy5、Cy5.5、CY3大多數Applied Biosystems?試劑都包含被動參比染料 ROX?，在多重qPCR中尤為有益。
柏恒科技Q9600系列無需ROX通道可進行多重實驗可自由選擇相應的染料，無需要進行染料校準。
引物濃度優
在單重TaqMan實驗中，通常推薦使用統一的引物濃度（900 nM）。
但在多重反應中，如果仍使用該濃度，可能會導致：高豐度靶標迅速擴增。
Taq DNA聚合酶被“耗盡”或飽和抑制低豐度靶標的擴增為避免這種情況，可對某些檢測項目采用降低引物濃度的策略。
研究人員應根據各靶標的預期豐度，決定哪些檢測項目需要進行引物限制。原理說明：
普通條件下，高豐度靶標擴增至聚合酶飽和后進入線性期低豐度靶標也被迫進入線性期，Ct值不準確甚至無法檢測，通過引物限制，使擴增因引物耗盡而非聚合酶飽和進入線性期，從而保證低豐度靶標仍處于指數擴增階段 提供：VIC標記、引物限制（PL）格式的基因表達檢測，定制 TaqMan?基因表達檢測特殊寡核苷酸合成服務，可選擇不同染料與PL格式，放大規模前的性能測試在正式應用多重qPCR 之前，必須對其性能進行驗證。
更嚴格的方法：混合標準曲線將一個靶標進行系列梯度稀釋同時加入固定量的第二個靶標。在實時PCR中擴增混合樣本。理想情況下，兩個靶標在整個檢測范圍內都應保持良好的線性關系對于三重或更高階多重反應，需要測試多組靶標組合。
較簡化的方法：對同一批樣本分別進行單重和多重擴增比較兩種結果的一致性將多重檢測整合為單管試劑，如果多重qPCR 的性能驗證結果令人滿意，可使用特殊寡核苷酸將所有檢測項目預混為單管形式。
其優勢包括：簡化實驗配制流程，確保引物和探針比例一致，提高實驗重復性。
